質(zhì)粒大量提試劑盒說(shuō)明書
本試劑盒采用堿裂解法裂解細(xì)胞，根據(jù)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA的原理特異性提取質(zhì)粒DNA。 離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專一地吸附DNA，可大限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物，一般從50-100ml大腸桿菌LB培養(yǎng)液中，可快速提取200-300μg高純度高拷貝的質(zhì)粒DNA，提取率達(dá)85-90%。 使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測(cè)序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)。
使用前請(qǐng)先在漂洗液中加入無(wú)水乙醇，加入體積請(qǐng)參照瓶體上的標(biāo)簽。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的 RNaseA 全部加入），混勻，置于 2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。
操作步驟:
1. 收集50-100ml培養(yǎng)的菌液11000rpm離心10分鐘，盡量吸除上清(菌液較多時(shí)可以通過(guò)多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中)。
2. 向留有菌體沉淀的離心管中加入5ml溶液Ⅰ (請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA) ，使用移液器或渦旋振蕩器*懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。注意：如果菌塊未*混勻，會(huì)影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。
3. 向離心管中加入5ml溶液Ⅱ ，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。 注意：①翻轉(zhuǎn)一定要溫和，以免污染細(xì)菌基因組DNA。②作用時(shí)間不要超過(guò)5分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞。
4. 向離心管中加入7ml溶液Ⅲ ，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀(如菌液過(guò)多，可在此步放置5分鐘，以盡可能的降解RNA)。11000rpm離心10分鐘，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中，注意盡量不要吸出沉淀。
注意：溶液Ⅲ加入后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。 如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。
5. 將上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室溫放置2-3分鐘，11000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中(如為提高得率，可將收集管中的液體加入吸附柱再次吸附一次)。
6. 向吸附柱中加入8ml漂洗液(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，11000rpm離心2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
7. 向吸附柱中加入6ml漂洗液，11000rpm離心2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。
8. 11000rpm離心5min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會(huì)影晌后續(xù)的實(shí)驗(yàn)如酶切、PCR等。
9. 將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜*懸空滴加1-2ml經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置5min，11000rpm離心2min，收集質(zhì)粒溶液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
10. 為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置5min， 11000rpm離心2min。
注意事項(xiàng):
1. 使用前請(qǐng)先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。溶液Ⅱ 、溶液Ⅲ和漂洗液使用后應(yīng)立即擰緊蓋子。
2. 洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于500ul，體積過(guò)小影響回收效率；洗脫液的pH值對(duì)洗脫效率也有影晌，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)此范圍)， pH值低于7. 0會(huì)降低洗脫效率。 DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。
3. 如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)粒或大于10kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，使用400-800ml培養(yǎng)物，同時(shí)按照比例增加溶液Ⅰ 、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時(shí)可以適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)時(shí)間，以增加提取效率。
4. DNA濃度及純度檢測(cè)：得到的質(zhì)粒DNA純度與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)。 得到的DNA可用瓊脂糖疑膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。 DNA應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當(dāng)于大約50μg/ml雙鏈DNA、 40μg/ml單鏈DNA。OD260/OD280比值應(yīng)為1.7-1.9，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會(huì)偏低，因?yàn)閜H值和離子存在會(huì)影響吸光值，但并不表示純度低。
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